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免疫磁珠

Protein L磁珠

货号

产品概述

本产品采用新一代纳米表面生物技术,将Protein L高密度共价偶联在超顺磁性纳米微球表面,是纯化大多数免疫球蛋白的理想工具。与传统的Protein L免疫沉淀琼脂糖凝胶相比,Protein L磁珠具有更大的特异性表面区域及更多的表面抗体结合位点,非特异性结合低,并且每次IP和Co-IP可以节省40%的时间,使用起来简便高效。
      Protein L磁珠可应用于多种样品,细胞裂解液、细胞分泌液上清、血清、动物腹水以及其它的免疫抗原等均可适用。

产品参数

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自备试剂

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操作步骤

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    样本处理
    1. 根据样品种类选择相应的处理方法:
        A. 血清样品:若目标蛋白丰度较高,建议用结合缓冲液或1×PBS(货号:PS110)稀释血清样品至目标蛋白终浓度为10~100μg/mL,置于冰上备用(或置于-20℃长期保存)
        B. 悬浮细胞:离心收集细胞(4℃,500×g,10min),弃上清后称重,按每毫克细胞50μL的比例用1×PBS(货号:PS110)洗涤2次;按每毫克细胞5~10μL的比例加入结合缓冲液 ,同时加入蛋白酶抑制剂(货号:GRF101),混匀后置于冰上孵育10min;离心收集上清液(4℃,14000×g,10min),置于冰上备用(或置于-20℃长期保存);
        C. 贴壁细胞:移去培养基,按每1.0×105个细胞150μL的比例用1×PBS(货号:PS110)洗涤两次;用细胞刮刀刮落细胞,收集至1.5mL离心管内,按每1.0×105个细胞20~30μL的比例加入结合缓冲液,同时加入蛋白酶抑制剂(货号:GRF101),混匀后置于冰上孵育10min;离心收集上清液(4℃,14000×g,10min),置于冰上备用(或置于-20℃长期保存);
        D. 大肠杆菌:离心收集大肠杆菌(4℃,12000×g,2min),弃上清后称重,按每克菌体(湿重)10mL的比例用1×PBS(货号:PS110)洗涤2次;按每克菌体(湿重)5~10mL的比例加入结合缓冲液,同时加入蛋白酶抑制剂(货号:GRF101),重悬菌体,超声裂解细胞,离心收集上清(4℃,12000×g,10min)。
        E. 组织样品:建议使用免疫(共)沉淀裂解液(货号:PS105)进行裂解,具体操作如下:
             ⑴把组织剪切成细小的碎片;
             ⑵按照每20mg组织样本150~250μL的比例加入裂解液;
                 注意:如果样本裂解不充分,可以适当提高裂解液的用量;若需要高浓度的蛋白样品,也可适当降低裂解液的用量。
             ⑶用玻璃匀浆器匀浆,直至样本充分裂解;
                 注意:若组织样本非常细小,可以适当剪切后直接加入裂解液,通过强烈涡旋振荡使其裂解充分。
             ⑷充分裂解后,10,000~14,000×g离心3~5min,小心地将上清液(蛋白样品)移入新的离心管中,即可进行后续步骤。

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    磁珠预处理
    2. 用移液器轻柔吹打Protein L磁珠,使其充分混悬,取25~50μL磁珠悬液置于1.5mL离心管中;
    3. 加入500μL结合缓冲液或1×PBS,用移液器轻柔吹打重悬磁珠,接着在磁力架上静置1min,待磁珠吸附到离心管侧壁上后,吸弃上清;
    4. 重复步骤3两次;

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    抗体与磁珠结合
    5. 稀释:用结合缓冲液或1×PBS稀释抗体样品至终浓度为5~50μg/mL,置于冰上备用;
    6. 结合:将400μL上步稀释好的抗体加入预处理后的磁珠中,置于翻转混合仪上孵育(常温2h,4℃ 4~6h或过夜),接着在磁力架上静置1min,待磁珠吸附到离心管侧壁上后,把上清液转移到新的离心管中备用(上清液可用于检测抗体是否存在残留),离心管中剩余的即为抗体-磁珠复合物;
       注意:结合过程中,磁珠可能会出现聚团或呈片状,属于正常现象,不会影响实验结果。
    7. 洗涤:在上一步得到的抗体-磁珠复合物中加入500μL结合缓冲液或1×PBS,用移液器轻柔吹打重悬磁珠,接着在磁力架上静置1min,待磁珠吸附到离心管侧壁上后,吸弃上清。再重复此步骤两次;

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    抗原与抗体-磁珠复合物结合
    8. 结合:向洗涤后的抗体-磁珠复合物中加入500μL步骤1制备好的样品,置于翻转混合仪上孵育(常温2h,4℃ 4~6h 或过夜),接着在磁力架上静置1min,待磁珠吸附到离心管侧壁上后,吸弃上清,离心管中剩余的即为抗原-抗体-磁珠复合物;
    9.洗涤:在上一步得到的抗原-抗体-磁珠复合物中加入500μL洗涤缓冲液或1×PBS,用移液器轻柔吹打重悬磁珠,接着在磁力架上静置1min,待磁珠吸附到离心管侧壁上后,吸弃上清。再重复此步骤三次;
    10.洗脱:本操作说明书提供以下两种抗原洗脱方案,操作者可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方法。
        ●变性洗脱:此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。向步骤9洗涤后的抗原-抗体-磁珠复合物中加入60μL 1×SDS-PAGE上样缓冲液(货号:LT101)混合均匀,100℃加热10min。待冷却后,将离心管在磁力架上静置1min,待磁珠吸附到离心管侧壁上后,收集上清,进行SDS-PAGE检测。
        ●非变性洗脱:此方法洗脱的样品保持原有的生物活性,可用于后期功能分析。向步骤9洗涤后的抗原-抗体-磁珠复合物中加入25~50μL洗脱缓冲液,室温孵育10min;将离心管在磁力架上静置1min,待磁珠吸附到离心管侧壁上后,收集上清液至新的离心管,并立即加入1μL中和缓冲液将洗脱产物pH调节至中性,用于后期功能分析。

常见问题及对策

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    如何避免磁珠在储存或使用过程中可能出现的聚集情况?
    答: 磁珠应保存在2~8℃,使用时应避免由于污染或干燥而导致的聚集。磁珠在低pH值的洗脱缓冲液中发生聚集属于正常现象,不影响磁珠的正常使用。在结合/洗涤缓冲液和洗脱缓冲液 中添加终浓度为0.1%(V/V)的非离子型去垢剂(如Triton X-100、Tween-20或NP-40)可有效防止磁珠聚集。经过低pH值洗脱操作的磁珠可以用结合缓冲液洗涤至中性,然后用含有0.1%(V/V)Tween-20的Tris buffer(pH7.5)振荡重悬磁珠,并用超声波水浴处理2min,即可使磁珠恢复均匀状态,以上处理均不影响磁珠的抗体结合效率。

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    磁珠在使用过程中出现结块现象?
    答: 磁珠在极少数情况下会出现结块现象,一般较难振荡打散,从而导致分布不均匀,这主要是因为磁珠在磁场中放置太久而牢固地结合在一起。用超声波水浴处理2min即可打散磁珠,但要注意超声处理也会使磁珠在样品溶液中捕获的抗体脱落,因此磁珠在加样后洗脱前不宜使用该方法。

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    如何提高抗体与磁珠结合效率?
    答: 磁珠抗体间的结合效率与抗体的种属来源及所属亚型有关,请确认抗体的类型与Protein L配基的亲和效率。如抗体所属亚型与Protein L的亲和度较低,可以通过增加抗体与磁珠的孵育时间(30~120min)、提高结合缓冲液的pH值(8~9)及降低离子强度(25~10mM NaCl)等方法提高亲和效率。

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    如何提高磁珠在免疫沉淀反应中的特异性?
    答: 可以先将抗体与样品进行孵育,形成抗体-抗原复合物,再用Protein L磁珠捕获复合物。这种方法可以提高抗体与抗原的结合效率,并降低磁珠与样品接触的时间,从而提高沉淀产物的特异性。对于蛋白质/核酸共沉淀或染色质免疫共沉淀也推荐使用此法。

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    如何解决磁珠易粘附管壁的现象?
    答: 建议使用低吸附率的耗材进行磁珠操作。另外,在缓冲液中添加0.01%~0.1%(V/V)的非离子型去垢剂(如Triton X-100、Tween-20或NP-40)可以有效降低耗材对磁珠的粘附。

注意事项

1. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作;

2. 本产品仅限科研使用。

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