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琼脂糖磁珠及免疫凝胶

His标签蛋白纯化琼脂糖凝胶

货号

产品概述

本产品可以用于纯化各种表达系统融合表达的His重组蛋白,其是以高度交联的 4%琼脂糖凝胶为基质,通过化学方法偶联三配位的亚氨基二乙酸(IDA),并螯合镍离子(Ni2+),形成比较稳定的平面四边形结构,从而有更多的位点与His标签上的咪唑环继续配位,达到结合目的蛋白的效果。

产品参数

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自备试剂

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操作步骤

  •    ◆

    样本处理(以大肠杆菌表达系统为例)
        1. 离心收集大肠杆菌(4℃,4,000×g,30min),弃上清;
        2. 用冷平衡缓冲液重悬细胞,同时加入蛋白酶抑制剂(货号:GRF101);
            注:所用试剂中不能含有 EDTA、EGTA 等螯合剂,DTT、巯基乙醇等还原剂,尿素、盐酸胍等变性剂。
        3. 用超声波破碎法在冰上破碎菌体,直到样品破碎完全;
        4. (可选)如果裂解物太过粘稠,可以加入RNase A(终浓度10μg/mL)和DNase I(终浓度5μg/mL)并在冰上孵育10~15min;
        5. 离心收集上清(4℃,12,000×g,20min);
        6. SDS-PAGE分析His融合蛋白的含量及可溶性;

  •    ◆

    纯化重组His融合蛋白
        7. 轻轻重悬His标签蛋白纯化琼脂糖凝胶,吸取适量加入重力柱中,用5~10倍柱体积的冷平衡缓冲液平衡His琼脂糖凝胶;
        8. 将步骤5制备好的含有His融合蛋白的上清液加入到纯化柱中,流速控制为0.5~1mL/min;
        9. 蛋白上清液全部流出纯化柱后,立刻加入漂洗缓冲液清洗纯化柱,所需量大约为柱体积的10~20倍或者直到流出液的A280值达到最低且稳定;
        10. 用5~10倍柱体积的现配洗脱缓冲液 以0.5~1mL/min的流速洗脱,收集洗脱液。或者根据流出液A280值判断,当数值陡然上升时开始接收洗脱液,直到A280数值降至最低且稳定时,停止收集。后续可根据目的蛋白的性质和用途,4℃透析到20mM Tris-HCl,pH8.0或者1×PBS,pH7.4中。

  •    ◆

    凝胶再生及储存
        11. 使用5倍纯化柱体积去离子水清洗琼脂糖凝胶填料;
        12. 使用5倍柱体积100mM EDTA(pH 8.0)剥落镍离子;
        13. 使用10倍柱体积去离子水清洗填料;
        14. 使用5倍柱体积0.5M NaOH清洗填料;
        15. 使用10倍柱体积去离子水清洗填料;
        16. 使用3~5倍柱体积100 mM NiSO4再生挂镍;
        17. 使用10倍柱体积去离子水清洗,即完成琼脂糖凝胶填料再生。
        注:填料再生后,可以立即使用,如不立即使用,需要将填料悬浮于等体积的20%乙醇中,置于4℃保存。

常见问题解析

  • YJ104-3.png

注意事项

1. 琼脂糖凝胶应保存在储存溶液中,防止干燥;

2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作;

3. 本产品仅限科研使用。

产品中心 / 蛋白表达纯化与分离 / 琼脂糖磁珠及免疫凝胶

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