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免疫(共)沉淀试剂盒

HA免疫(共)沉淀试剂盒

货号

产品概述

本产品能够高效完成抗原免疫沉淀(IP)及免疫共沉淀(Co-IP)实验,其核心成分Anti-HA免疫磁珠采用新一代纳米表面生物技术,将鼠源单克隆Anti-HA抗体高密度共价偶联在超顺磁性纳米微球表面,是纯化HA标签蛋白的理想工具。与市场上同类产品相比,其具有更大的特异性表面区域及更多的表面抗体结合位点,非特异性结合率低,10min内即可完成抗体吸附过程,30min内完成抗原沉淀操作,使用起来简便高效。可有效避免长时间操作造成目标蛋白被水解,确保了目标蛋白的活性及蛋白复合物的完整性。
      此外,本试剂盒中配有经过优化预制的各种缓冲液,为免疫(共)沉淀实验提供了合适的反应条件,增强了实验的稳定性,可应用于多种样品,细胞裂解液、细胞分泌液上清、血清、动物腹水以及其它的免疫抗原等均可适用。

产品内容

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操作步骤

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    样本处理
    1. 根据样品种类选择相应的处理方法:
        A. 血清样品:若目标蛋白丰度较高,建议用裂解/漂洗缓冲液稀释血清样品至目标蛋白终浓度为50~150μg/mL,置于冰上备用(或置于-20℃长期保存);
        B. 悬浮细胞:离心收集细胞(4℃,500×g,10min),弃上清后称重,按每毫克细胞50μL的比例用1×PBS(货号:PS110)洗涤2次;按每毫克细胞5~10μL的比例加入裂解/漂洗缓冲液,同时加入蛋白酶抑制剂(货号:GRF101),混匀后置于冰上孵育5~20min(期间混匀几次);离心收集上清液(4℃,12,000~16,000×g,10min),置于冰上备用(或置于-20℃长期保存);
        C. 贴壁细胞:移去培养基,按每1.0×105个细胞150μL的比例用1×PBS(货号:PS110)洗涤两次;用细胞刮刀刮落细胞,收集至1.5mL离心管内,按每1.0×105个细胞20~30μL的比例加入裂解/漂洗缓冲液,同时加入蛋白酶抑制剂(货号:GRF101),混匀后置于冰上孵育5~20min(期间混匀几次);离心收集上清液(4℃,12,000~16,000×g,10min),置于冰上备用(或置于-20℃长期保存);
        D. 大肠杆菌:离心收集大肠杆菌(4℃,12,000×g,2min),弃上清后称重,按每克菌体(湿重)10mL的比例用1×PBS(货号:PS110)洗涤2次;按每克菌体(湿重)5~10mL的比例加入裂解/漂洗缓冲液,同时加入蛋白酶抑制剂(货号:GRF101),重悬菌体,超声裂解细胞,离心收集上清(4℃,12,000~16,000×g,10min)

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    磁珠预处理
    2. 用移液器轻柔吹打Anti-HA免疫磁珠 ,使其充分混悬,取25μL磁珠悬液置于1.5mL离心管中;
    3. 加入500μL裂解/漂洗缓冲液,用移液器轻柔吹打重悬磁珠,接着在磁力架上静置1min,待磁珠吸附到离心管侧壁上后,吸弃上清;
    4. 重复步骤3两次;

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    样品的结合
    5. 在预处理后的磁珠中加入500μL步骤1制备好的样品,置于翻转混合仪上孵育(常温1h,4℃ 4~6h或过夜);
    6. 将上述混合液置于磁力架上静置1min,然后把上清液转移到新的离心管中备用(上清液可用于检测HA标签蛋白是否存在残留),原离心管中剩余的即为蛋白-磁珠复合物;

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    洗涤
    7. 向步骤6所得的蛋白-磁珠复合物中加入500μL裂解/漂洗缓冲液,用移液器轻柔吹打重悬,接着在磁力架上静置1min后,吸弃上清;
    8. 重复步骤7大约三次,直至洗涤后的上清液OD280小于0.05为止;
      注意:如上清液的 OD280 仍大于 0.05,则适当增加洗涤次数。

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    洗脱
    9. 本操作说明书提供以下两种抗原洗脱方案,操作者可根据后期检测的需要选择不同的抗原洗脱方法。
        ●变性洗脱:此方法洗脱的样品适用于SDS-PAGE检测。向步骤8洗涤后的蛋白-磁珠复合物中加入80~100μL 1×SDS-PAGE上样缓冲液(由5×稀释为1×)混合均匀,100℃加热10min。待冷却后,将离心管在磁力架上静置1min,待磁珠吸附到离心管侧壁上后,收集上清,进行SDS-PAGE检测。
        ●非变性洗脱:此方法洗脱的样品保持原有的生物活性,可用于后期功能分析。向步骤8洗涤后的蛋白-磁珠复合物中加入50~100μL洗脱缓冲液,室温孵育5~10min;将离心管在磁力架上静置1min,待磁珠吸附到离心管侧壁上后,收集上清液至新的离心管,每100μL洗出液中加入10μL中和缓冲液将洗脱产物pH调节至中性,用于后期功能分析。

常见问题及对策

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    如何避免磁珠在储存或使用过程中可能出现的聚集情况?
    答: 磁珠应保存在2~8℃,使用时应避免由于污染或干燥而导致的聚集。不过,磁珠在低pH值的缓冲液中发生聚集属于正常现象,不影响磁珠的正常使用。在裂解/漂洗缓冲液中添加终浓度为0.1%(V/V)的非离子型去垢剂(如Triton X-100、Tween-20或NP-40)可有效防止磁珠聚集。经过低pH值洗脱操作的磁珠可以用裂解/漂洗缓冲液洗涤至中性,然后用含有0.1%(V/V)Tween-20的Tris缓冲液(pH7.5)振荡重悬磁珠,并用超声波水浴处理2min,即可使磁珠恢复均匀状态,以上处理均不影响磁珠的抗体结合效率。

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    如何解决磁珠易粘附管壁的现象?
    答: 建议使用低吸附率的耗材进行磁珠操作。另外,在缓冲液中添加0.01%~0.1%(V/V)的非离子型去垢剂(如Triton X-100、Tween-20或NP-40)可以有效降低耗材对磁珠的粘附。

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    抗原为何没有免疫沉淀下来?
    答: ①样品中抗原含量过少,不足以被检测到
             建议:通过SDS-PAGE或Western Blot验证裂解液中蛋白的表达和裂解效率;如有必要,可加大样品用量;
           ②裂解/漂洗缓冲液中的成分干扰了抗原与抗体的结合
             建议:使用其它缓冲液进行免疫沉淀和漂洗(比如可选用含有0.5% CHAPS的TBS缓冲液)。

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    为何获得的蛋白量过低?
    答: ①蛋白质被降解
             建议:加入蛋白酶抑制剂;
           ②所用的Anti-HA免疫磁珠量不够
             建议:提高Anti-HA免疫磁珠用量;
           ③样品中的目标蛋白量不够
             建议:提高抗原样品量。

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    为何有多条非特异条带?
    答: 有非特异性的蛋白结合在磁珠上
           建议:在裂解/漂洗缓冲液中加入50~350mM NaCl,并加大洗脱力度和次数。

注意事项

1. 请勿高速离心、干燥或冷冻磁珠,这些操作会导致磁珠聚集而降低其结合力;

2. 免疫(共)沉淀实验中不同类型的抗体与抗原间的亲和力是有区别的,抗体与抗原结合还会受到裂解/漂洗缓冲液的影响,因此,如使用本试剂盒不能获得最佳的实验结果,可自行优化操作细节或者筛选及配制合适缓冲液进行实验;

3. 磁珠应保存在储存溶液中,防止干燥,使用前应充分振荡混匀;

4. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作;

5. 本产品仅限科研使用。

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