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核酸提取

总RNA提取试剂

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产品概述

本产品适用于从细胞和组织中快速分离RNA/DNA/蛋白质。整个实验操作简单省时,所提取的RNA纯度高,可用于Northern Blot、PolyA RNA富集、体外翻译、RNase保护分析、反转录等下游实验。本品含有苯酚,如不慎接触皮肤,应立即用大量流水冲洗。

产品特点

  • 色彩鲜艳

    便于区分水相和有机相的分界面,方便吸取上清
  • 高性价比

    产品质量丝毫不逊色于进口同类产品,而价格仅为其一半左右

使用说明

  • 请确保您所使用的离心管、移液器吸头以及其它器皿未被RNase污染。金属和玻璃制品可在200℃烘烤2h以上。塑料制品和水可用0.01%的DEPC水浸泡过夜,高压灭菌。所有溶液应使用DEPC处理后的水配制。

  •    ◆

    分离 RNA
    1. 裂解匀浆:
        A. 组织样品 将组织用液氮在研钵中速冻后,碾磨成极细的粉末,期间应不断添加液氮,保持组织样品处于冷冻状态。按50~100mg组织加入1mL总RNA提取试剂(样品体积不应超过试剂体积的10%),此时总RNA提取试剂由于低温会凝固。继续研磨,尽量将凝固的试剂在其融化前磨成粉末,以使总RNA提取试剂和组织粉末尽快混合充分。几分钟后,随着研钵温度的上升,总RNA提取试剂会慢慢融化。充分研磨匀浆样品后,将裂解液转移到一个新的1.5mL离心管内。若使用的组织为容易匀浆的样本,如大脑、肝脏等,可直接用玻璃匀浆器匀浆。
        B. 贴壁培养的细胞 吸去培养板中的培养基,按每10cm2(相当于一个3.5cm直径的培养皿或6孔板的一个孔的面积)培养面积直接加入1mL总RNA提取试剂。晃动培养板,使总RNA提取试剂反复流过培养细胞的表面,待所有贴壁的细胞裂解后,将裂解液转移到一个新的1.5mL的离心管内。
        C. 悬浮培养的细胞 离心收集细胞(无需洗涤细胞,洗涤过程极有可能会使RNA降解),按每5~10×106个动物、植物、酵母细胞或1×107个细菌细胞加入1mL总RNA提取试剂,反复吹打,使细胞分散裂解。一些酵母细胞或细菌细胞可能需要用匀浆仪处理。
    2. 裂解后的匀浆液于室温放置5min,使核酸和蛋白质复合体完全分离;
    3. 可选:若样品中含有较多组织碎片或多糖等不溶物质(常见于抽提植物组织RNA时),可于4℃ 12,000×g离心10min,取上清液进行下一步操作;
    4. 按每使用1mL总RNA提取试剂加入0.2mL氯仿,剧烈震荡混匀15s,室温放置3~5min;
    5. 于4℃ 12,000×g离心15min。样品将分为三层:下层为绿色有机相,上层为无色水相,中间层为白色的DNA和蛋白质;
    6. 吸取上层水相,转移到一个干净的离心管中。加入等体积异丙醇,室温放置10min沉淀RNA。小分子RNA(如microRNA等)在异丙醇沉淀过程中会大量丢失。因此如希望回收microRNA等小分子RNA,可改用2.5倍体积乙醇,于-20℃沉淀30min以上。如需同时纯化DNA和蛋白质,请保留有机相和中间层;
    7. 于4℃ 12,000×g离心10min,收集沉淀。离心后,管底和管侧壁可见白色或半透明状RNA沉淀。弃上清;
    8. 用1mL 75%乙醇洗涤RNA沉淀。于4℃ 12,000×g离心10min,弃上清;
    9. 将离心管放回离心机轻甩几秒,使残留在管壁的乙醇溶液集中到管底,用移液器吸头小心吸去残余的乙醇溶液;
    10. 打开离心管盖,室温晾干RNA沉淀。一般3~5min即可。加入适量无RNase水溶解沉淀。

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    分离 DNA
    1. 在上述分离RNA第6步的有机相和中间层中,按每使用1mL总RNA提取试剂加入0.3mL无水乙醇,混匀,室温放置3min,于4℃ 12,000×g离心5min;
    2. 将上清转移到一个新的离心管内,以备后续分离蛋白。DNA沉淀用含10%乙醇的0.1M柠檬酸钠溶液充分洗涤。按每使用1mL总RNA提取试剂加入1mL洗涤液,室温放置30min,于4℃ 12,000×g离心5min,弃上清,重复一次;
    3. 用75%乙醇洗涤沉淀。按每使用1mL总RNA提取试剂加入1.5mL 75%乙醇,室温放置10~20min,期间不时颠倒混匀。于4℃ 12,000×g 离心5min,弃上清;
    4. 室温晾干DNA沉淀。用8mM的NaOH溶液溶解DNA;
    5. 将DNA溶液pH调整至7.5。按每1mL 8mM NaOH溶液加入160μL 0.1M的HEPES溶液。

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    分离蛋白质
    1. 取沉淀DNA后的上清,按每使用1mL总RNA提取试剂加入1.5mL异丙醇,室温放置10min,于4℃ 12,000×g离心5min,弃上清;
    2. 用含0.3M盐酸胍的95%乙醇洗涤蛋白质沉淀。按每使用1mL总RNA提取试剂加入2mL洗涤液,室温放置20min,于4℃ 7,500×g离心5min,弃上清。重复两次后,用2mL无水乙醇再洗一次;
    3. 晾干沉淀,用1% SDS溶液溶解蛋白沉淀,必要时可于50℃加热助溶。离心,弃不溶物。上清即可用于Western Blot分析。

注意事项

1. 本品含有苯酚,如不慎接触皮肤,应立即用大量流水冲洗;

2. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作;

3. 本产品仅限科研使用。

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