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小鼠Elisa

Mouse IL-1β ELISA Kit

货号

小鼠白细胞介素1β酶联免疫吸附测定试剂盒

Mouse IL-1β ELISA Kit

产品参数

货号
HJ177
规格96次
检测范围12.5pg/mL~800pg/mL
敏感性5pg/mL
特异性系统和其它因子无交叉反应
样本类型小鼠血清、血浆、体液、组织匀浆或细胞培养上清

产品概述

      本试剂盒采用双抗体夹心ELISA法检测样品中小鼠IL-1β的浓度。小鼠IL-1β捕获抗体已经预包被于酶标板上,当加入样品或标准品时,其中的小鼠IL-1β会与捕获抗体结合,而其它游离成分则会通过洗涤被除去。接着,再加入生物素标记的小鼠IL-1β抗体后,抗小鼠IL-1β抗体与小鼠IL-1β接合,形成夹心的免疫复合物,其它游离成分则通过洗涤被除去。随后加入酶复合物,生物素与酶复合物特异性结合,这样酶复合物上的HRP就与夹心的免疫复合物连接起来,而其它游离成分则通过洗涤被除去。最后加入显色剂,若样品中存在小鼠IL-1β,则会形成免疫复合物,其上连接的HRP会催化无色的显色剂氧化生成蓝色物质,而后加入终止液,最终产物呈黄色。通过酶标仪检测,读取450nm处的OD值,小鼠IL-1β浓度与OD450值之间呈正比,通过检测标准品绘制标准曲线,对照未知样品中OD值,即可计算出样品中小鼠IL-1β的浓度。

产品内容

分组
体积或数量
小鼠IL-1β预包被板8孔条×12个
样品稀释液30mL
重组小鼠IL-1β标准品(冻干)2支(10ng/支)
生物素标记小鼠IL-1β抗体130μL(效价1:100)
抗体稀释液12mL
酶复合物(HRP标记的链霉亲和素)130μL(效价1:100)
酶复合物稀释液12mL
浓缩洗涤液(25×)30mL
显色剂TMB10mL
终止液10mL
封板胶纸4张

操作步骤

  • 样品制备

    1. 根据样品种类选择相应的处理方法:

        A. 细胞上清:将细胞培养上清液100~500×g离心5min,去除悬浮物后即可;
        B. 血清样品:将全血在室温下静置0.5~2h,待其自然凝固并析出血清后,离心取黄色上清即可(4℃,1,000~2,000×g,10min),注意请勿吸取沉淀,制备好的血清需置于冰上待用,请勿在其中添加任何防腐剂或抗凝剂;
        C. 血浆样品:使用EDTA对全血进行抗凝处理后,混合均匀置于冰上,离心取黄色上清即可(4℃,1,000~2,000×g,10min),注意请勿吸取沉淀,制备好的血浆需置于冰上待用;
        D. 组织均浆/体液:离心去除沉淀即可。
        注意:①若待测样品无法及时检测,样品制备完成后,请分装冻存于-20℃,避免反复冻融;
        注意:②请保证待测样品清澈透明,检测前如发现样品中有悬浮物,需通过离心去除;
        注意:③为了保证检测结果准确,请勿使用溶血、黄疸、高血脂或污染的样品。

    2. 稀释样品

        查阅相关文献,预估样品中待测因子的含量,从而确定适当的稀释倍数,使稀释后样品中待测因子的浓度处于ELISA试剂盒的最佳检测范围。根据待测因子含量的不同,分别采取不同的稀释方案:
        ① 待测因子含量在8~80ng/mL范围内,一般按1:100稀释,即向297μL样品稀释液中加入3μL样品;
        ② 待测因子含量在0.8~8ng/mL范围内,一般按1:10稀释,即向225μL样品稀释液中加入25μL样品;
        ③ 待测因子含量在12.5~800pg/mL范围内,一般按1:2稀释,即向100μL样品稀释液中加入100μL样品;
        ④ 待测因子含量≤12.5pg/mL,样品一般无需稀释。
        以上方案仅供参考,实验中请详细记录样品的稀释方法。


  • 检测准备工作

    3. 试剂盒自4℃冰箱取出后,请置于室温平衡20min;如从﹣20℃取出,各组分需彻底融化后再平衡20min;检测完成后,剩余试剂请及时置于4℃或-20℃保存;

    4. 将浓缩洗涤液(25×)用双蒸水或去离子水稀释成1×洗涤液;

    5. 重组小鼠IL-1β标准品的稀释和使用(在使用前2h内准备,室温操作,请严格控制在25~28℃)
        ①配制10ng/mL标准品:取1mL样品稀释液加入标准品管内,盖好后静置15min以上,然后反复颠倒/搓动以助溶解;
        ②配制800pg/mL标准品:取80μL 10ng/mL的标准品加入有920μL样品稀释液的EP管中,混匀,做上标记;
        ③按下表将800pg/mL标准品用样品稀释液进行倍比梯度稀释。(最高浓度为800pg/mL,将标准品稀释液作为浓度0pg/mL。)


  • 管号
    稀释液用量(μL)复溶后标准品用量(μL)
    标准品的最终浓度(pg/mL)
    A01,000800
    B300300(从A管中取)400
    C300300(从B管中取)200
    D300300(从C管中取)100
    E300300(从D管中取)50
    F300300(从E管中取)25
    G300300(从F管中取)12.5
    H30000
    注意:标准品复溶加样后,剩余部分请丢弃。

    6. 准备生物素标记小鼠IL-1β抗体工作液
        ①按每孔需添加100μL抗体工作液,计算其总用量(为弥补操作中的损耗,需多配制100~200μL);
        ②按1μL生物素标记小鼠IL-1β抗体添加99μL抗体稀释液的比例配制工作液,轻轻混匀。

    7. 准备酶复合物工作液(需在使用前1h内准备)
        ①按每孔需添加100μL酶复合物工作液,计算其总用量(为弥补操作中的损耗,需多配制100~200μL);
        ②按1μL酶复合物添加99μL酶复合物稀释液的比例配制工作液,轻轻混匀。


  • 检测流程

    8. 通过计算确定一次实验所需的板条数,取出所需板条放置于框架内,多余的板条请放回铝箔袋密封,保存于4℃或-20℃;
        注意:① 标准品和样品建议做双复孔检测;
        注意:② 每次实验均需绘制标准曲线。

    9. 将用样品稀释液稀释后的样品和不同浓度标准品(100μL/孔)分别加入相应孔中,用封板胶纸封住反应孔,37℃孵育90min;
        注意:① 请查阅相关文献确定样品中待检测蛋白的大致浓度,若其大于本试剂盒标准曲线的最大标准品浓度,请将样品适当稀释后再进行检测;
        注意:② 整个加样过程不宜超过10min,否则可能会影响检测结果。

    10. 甩去酶标板内液体,无需洗板,将板倒扣在吸水纸上拍干;

    11. 加入稀释后的生物素标记小鼠IL-1β抗体工作液(100μL/孔),用封板胶纸封住反应孔,37℃孵育60min;

    12. 洗板5次,每孔1×洗涤液用量为300μL,注入与吸出间隔15~30s,洗完后将板倒扣在吸水纸上拍干;
        注意:洗涤过程至关重要,洗涤不充分会导致结果产生较大误差。

    13. 加入稀释后的酶复合物(100μL/孔),用封板胶纸封住反应孔,37℃避光孵育30min;

    14. 洗板5次,方法同步骤12;

    15. 加入显色剂TMB(100μL/孔),用封板胶纸封住反应孔,避光37℃反应10~25min;
        注意:① 在保存和使用时,请勿将TMB接触氧化剂和金属;
        注意:② 因实验室条件差异,最佳显色时间会有所不同。反应充分时肉眼可见标准品的前3~4孔有明显的梯度蓝色。

    16. 加入终止液(100μL/孔),混匀后即刻使用酶标仪测量OD450,同时设定540nm或570nm作为校正波长,即可计算得到校正吸光度值 (OD450-OD540或OD450-OD570);
        注意:读取OD值建议在10min内完成。


  • 数据分析

    17. 绘制标准曲线。以标准品浓度作横坐标,OD值作纵坐标,利用计算机软件作四参数逻辑(4-PL)曲线拟合创建标准曲线,通过样品的OD值即可在标准曲线上计算出其相应浓度。
        注意:① 复孔OD值在20%的差异范围内结果才有效,复孔OD值取平均后可作为测量值;
        注意:② 若样品OD值高于标准曲线上限,应适当稀释后重测,计算浓度时应乘以稀释倍数。


  • 标准曲线范例


    hj177.png

注意事项

1. 浓缩洗涤液低温情况下可能会出现结晶,请水浴加热使结晶完全溶解后再配制工作液;

2. 严禁混用不同批号试剂盒的组分;

3. 加样过程请避免产生气泡,实验操作过程中一定要保证试剂充分混匀,否则会使结果产生较大误差;

4. 说明书中提到的室温条件,请严格控制在25~28℃;

5. 为了您的安全和健康,请穿实验服并戴一次性手套操作;

6. 本产品仅限科研使用。

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